La biopsia embrionaria è oggi largamente utilizzata per migliorare i risultati clinici in termini di impianto embrionario, gravidanza clinica e percentuale di nascite. Tale tecnica permette di individuare e quindi trasferire gli embrioni euploidi. Il Test Genetico Preimpianto (PGT) fu introdotto per la prima volta nel 1993. Le prime biopsie portarono ad uno scarso incremento nell’aumento della percentuale delle nascite, questo perché lo screening genetico che veniva utilizzato (FISH) analizzava solo un ridotto numero di cromosomi. Lo sviluppo successivo di tecniche più sofisticate (a-CGH; NGS; rtq-PCR) portò ad un notevole vantaggio, ovvero permise l’analisi dell’intero pannello cromosomico, rendendo i risultati dell’analisi genetica più affidabili e completi. Dal punto di vista prettamente tecnico la biopsia embrionaria consiste nel prelevare un piccolo campione di cellule dall’embrione (1° e/o 2° globulo polare, 1/2 blastomeri o 5/8 cellule del trofoectoderma) al fine di analizzarlo dal punto di vista genetico. La biopsia dei globuli polari viene utilizzata nei Paesi con particolari restrizioni legali sulla valutazione genetica dell’embrione. La biopsia dei blastomeri viene eseguita quando l’embrione ha raggiunto lo stadio di 6-8 cellule. Tramite l’uso del laser si crea un piccolo foro nella zona pellucida dell’embrione, si rimuovono 1 o 2 cellule (blastomeri)su cui si eseguirà l’analisi genetica. Infine, la biopsia sulle cellule del trofoectoderma si esegue quando l’embrione ha raggiunto lo stadio di blastocisti espansa. La blastocisti è formata da due diversi tipi di cellule: le cellule della massa cellulare interna, che daranno origine ai tessuti fetali e il trofoectoderma, precursore della futura placenta. Anche in questo caso si fora la zona pellucida della blastocisti con il laser e si preleva un piccolo gruppo di cellule (5/8) che rappresenta solo una minima quantità di tutto il trofoblasto. In questo caso la blastocisti dovrà essere crioconservata per un eventuale futuro trasferimento qualora risultasse euploide. Quest’ ultimo metodo è il più utilizzato in quanto è quello che dà una maggiore garanzia di risultato in termini di gravidanza clinica e percentuale di nascite. Si è visto inoltre, che le blastocisti biopsiate in giorno 5 hanno una maggiore probabilità di essere euploidi rispetto a quelle che hanno raggiunto lo stadio idoneo alla biopsia in giorno 6 o 7. Va comunque detto che un embrione euploide biopsiato in giorno 7, ha le stesse probabilità di esitare in una gravidanza di un embrione euploide fatto in giorno 5. Questo ci fa capire quanto sia importante eseguire la biopsia su tutte le blastocisti disponibili, indipendentemente dal loro timing di crescita. Il Test Genetico Preimpianto è sicuramente una tecnica invasiva che deve essere eseguita da embriologi esperti, in quanto vi è una piccola probabilità di danno all’embrione. A tale proposito si stanno studiando delle tecniche non invasive che diano informazioni sul genoma dell’embrione. Ad oggi esistono 2 alternative alla biopsia embrionaria, ovvero l’analisi del fluido presente all’interno della blastocisti e la ricerca del DNA embrionario nel terreno di coltura in cui è immersa la blastocisti. Sebbene molto promettenti, queste tecniche, paragonate alla biopsia embrionaria, non danno ancora dei risultati attendibili al 100%, ne consegue che gli studi su queste procedure dovranno essere ulteriormente approfonditi. Concludendo si può affermare che il test genetico preimpianto (PGT) è una valida tecnica per la valutazione degli embrioni euploidi prima di un transfer. BLIOGRAFIA Dahdouh E.M., Balayla J., García-Velasco J.A. 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Quando hai superato i 30 anni e tutti intorno a te diventano genitori e tu… ogni tanto vorresti ed ogni tanto adori la tua libertà. Ma l’orologio biologico inizia a ticchettare sempre più forte e sempre più rapido. Ti fai mille domande e poi decidi di iniziare a fare dei tentativi “soft”. Purtroppo sai già che per un problema di amenorrea da sola non potrai farcela, quindi prendi coscienza e inizi a tentare facendo dei monitoraggi dell’ovulazione con l’aiuto di una stimolazione. La prima volta che devi fare la puntura sulla pancia hai un po’ di ansia, pensi di non essere capace, di poter sbagliare, invece è decisamente più facile del previsto, forse è peggio per chi ti osserva da esterno che per te stessa. Inizia così il vortice: puntura/ecografia/puntura/ecografia/ e poi arriva il giorno giusto e poi 15 giorni dopo segue il fatidico test. Negativo, negativo, negativo. Forse il mio problema è più grande di quello che avevo messo in conto, ma i medici del resto mi avevano avvisata e quindi bisogna provare qualcosa di più incisivo. Quindi con grande consapevolezza e l’appoggio del partner, si decide di passare al livello successivo, nel nostro caso una ICSI. Ci sono molti esami da fare oltre alla routine ormai conosciuta di punture, ecografie e dosaggi ormonali. Il percorso non è semplice, organizzare gli incastri con il lavoro e l’agenda del centro non è facile ma cercano sempre di venire incontro alle esigenze dei pazienti, questo vale per tutto lo staff al completo: sempre disponibili a rispondere alle domande, a volte anche stupide, che facciamo noi pazienti. Quando arriva il momento del pick up l’ansia è a mille, il giorno del transfer ancora di più. Ma non ci sente mai soli o abbandonati, ci sono sorrisi gentili e spiegazioni costanti. L’attesa più lunga è quella del dosaggio delle BHG: quando arriva il referto quasi non si vuole aprirlo, è tutto li in quel numero. Quando l’ho visto non potevo crederci! Positivo! Avevo solo una possibilità perché le mie uova non erano bellissime e solo una si è fecondata bene, da subito è partita alla grande, si evolveva bene e … ha attecchito bene! Qualche giorno fa ho ricevuto l’esito del mio test prenatale, aspetto un maschietto! È sano e arriverà a fine anno! Grazie al Centro per la disponibilità, la gentilezza, le spiegazioni, gli incoraggiamenti e i sorrisi. ;

Oggi insieme al Dr. Roberto Sodano, embriologo clinico di CMR, vogliamo affrontare il tema della selezione microfluidica degli spermatozoi durante un ciclo di fecondazione in-vitro. Oggigiorno sono sempre di più le coppie che si rivolgono ad un centro di medicina della riproduzione aventi un deficit di qualità del liquido seminale. Basti pensare che il 5-10% degli uomini sposati ha o ha avuto problemi a riprodursi. Un recente studio ha dimostrato come la necessità per gli uomini di ricorrere ad un trattamento di fertilità sia in aumento del 9% negli ultimi dieci anni. Questo studio conferma, con un’analisi di un amplissimo campione, un trend già evidenziato da molti ricercatori in diversi lavori pubblicati nell’ultimo decennio. Nel 2011, un’analisi pubblicata sulla rivista “Human Reproduction Update” ha rilevato già una riduzione drastica del numero medio degli spermatozoi per ogni uomo sano, passando da 99 milioni per millilitro nel 1973 a 47 milioni. Non è chiaro cosa ha determinato questo peggioramento, ma le mutate abitudini e stili di vita (alcool, fumo, cattiva alimentazione, stress), l’inquinamento ambientale e dei luoghi di lavoro hanno avuto sicuramente un peso determinante. Durante un ciclo di fecondazione in vitro in laboratorio viene analizzato il liquido seminale. Successivamente alla valutazione dei parametri quantitativi e qualitativi, avviene una selezione degli spermatozoi da impiegare per l'inseminazione degli ovociti mediante separazione per gradienti di densità.In questa procedura avviene la rimozione del plasma seminale mediante lavaggio, la valutazione del numero di spermatozoi "migliori" dal punto di vista morfologico e di motilità, separandoli dagli spermatozoi morti e dai detriti. Negli ultimi anni è stata introdotta un'innovativa metodologia di selezione degli spermatozoi applicata durante un ciclo di fecondazione in vitro, ovvero la selezione microfluidica. Questo è un metodo selettivo degli spermatozoi che prevede l'utilizzo di un chip. Il metodo si basa sul principio della selezione naturale degli spermatozoi passando attraverso microcanali che simulano l’ambiente naturale del sistema riproduttivo femminile. Questi microcondotti funzionano come un filtro che seleziona solo spermatozoi di alta qualità. Con l'impiego della selezione microfluidica degli spermatozoi viene ridotto il rischio di ROS (Reactive Oxygen Species) e di danni al DNA dello spermatozoo, di conseguenza gli spermatozoi selezionati hanno una migliore morfologia, DNA non frammentato e più del doppio della vitalità e della motilità nei confronti degli spermatozoi non selezionati. Con la microfluidica però i liquidi seminali gravemente compromessi (criptozoospermici e campioni provenienti da biopsie e/o agoaspirazioni testicolari) non possono essere trattati. Infine l'impiego della selezione microfluidica permette agli operatori una maggiore rapidità di esecuzione della tecnica, aumenta il tasso di successo della gravidanza e riduce significativamente il numero di aborti durante la fecondazione in vitro. Riassumendo la microfluidica garantisce: massima imitazione del meccanismo naturale di selezione degli spermatozoi selezione di soli spermatozoi di alta qualità con il DNA non frammentato maggiore rapidità di esecuzione della tecnica riduzione significativa del rischio di aborto spontaneo nessuna centrifugazione con riduzione dello stress ossidativo degli spermatozoi. Viene indicata nei pazienti con: elevata frammentazione del DNA spermatico IUI ripetutamente fallite un tasso basso di fecondazione degli ovociti utilizzando il metodo ICSI aborti ripetuti embriotransfer ripetuto senza successivo annidamento dell'embrione qualità insufficiente degli embrioni BIBLIOGRAFIA: Total Motile Sperm Count Trend Over Time: Evaluation of Semen Analyses From 119,972 Men From Subfertile Couples. Ashley W Tiegs, Jessica Landis, Nicolás Garrido, Richard T Scott Jr, James M Hotaling Comparison of microfluid sperm sorting chip and density gradient methods for use in intrauterine insemination cycles. Gode, F., Bodur T., et al. Fertility and Sterility (2019). doi: 10.1016/j.fertnstert.2019.06.037 A treatment approach for couples with disrupted sperm DNA integrity and recurrent ART failure. Parrella, A., Keating, D., Cheung, S. et al. J Assist Reprod Genet (2019). doi: 10.1007/s10815- Selection of Functional Human Sperm with Higher DNA Integrity and Fewer Reactive Oxygen Species. Asghar, W., Velasco, V., Kingsley, J. L. et al. Adv. Healthcare Mater. (2014), 3: 1671-1679. doi: 10.1002/adhm.201400058 ;